CAS OpenIR  > 中科院上海应用物理研究所2011-2019年
基于DNA折纸的DNA复制的原子力显微术研究
王奇
Subtype硕士
Thesis Advisor李宾
2014
Degree Grantor中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)
Degree Discipline生物工程
Keyword原子力显微镜 Dna折纸 Dna复制 单分子
AbstractDNA复制是生命体内必不可少的重要过程,在基础研究、临床诊断和法医上都有重要应用。DNA复制是新DNA的合成,合成与单链模板DNA完全相同的新的DNA分子,形成DNA双链。尽管对DNA复制研究已经非常深入而细致,然而,单分子水平上DNA复制的研究依然存在挑战,对如何获取一条DNA链由单链转变成双链DNA分子的复制延伸信息缺乏相应检测手段。本文利用DNA折纸寻址性的特点以及原子力显微镜纳米级的高分辨能力,通过成像手段,直接观察DNA聚合酶I片段(KF)与DNA的相互作用过程,在单分子水平上开展对DNA复制延伸过程的检测和表征。研究内容主要围绕两个方面展开:(1)两端固定于DNA折纸上的单个DNA分子的复制和检测;(2)DNA复制过程中单个DNA聚合酶片段(KF)动态过程的实时检测以及其他因素对DNA聚合酶I与DNA相互作用的影响。 (1)两端固定于DNA折纸上的单个DNA分子的复制和检测;首先,通过自组装方法构建三角形DNA折纸,再将DNA模板链通过碱基互补配对连接在折纸的特定位点。凝胶电泳分析和AFM成像检测结果表明,当DNA单链模板链浓度大于DNA折纸浓度10倍以上时,连接效率较好,可达到50%以上。而且,KF能够与一条两端点固定在DNA折纸上的单链DNA模板结合,发挥其聚合能力,使单链DNA模板转变成了双链DNA。通过生物素亲和素分子识别体系,进一步验证了KF了对两末端固定在三角形DNA折纸上单链DNA模板链的复制。 (2)DNA复制过程中单个KF动态过程的实时检测以及其他因素对KF与DNA相互作用的影响。采用AFM成像手段,在云母表面上,实时观察了KF与DNA链的结合、移动以及解离的催化过程。同时,溶液体系结果也表明,在不含有dNTPs情况下,KF大多结合在DNA模板的5’端,而在加入dNTPs后,DNA模板5’端的KF随之减少,提示随着反应的进行,KF的移动方向与新生链合成方向5’端至3’端的方向一致。此外,为了验证此方法的普适性,对相对较长的长链的DNA模板链的复制延伸也进行了检测。通过改变部分订书钉链序列在折纸上获得长模板链的方法,并同样在该模板上检测到了DNA复制。除此之外,我们探索了温度,Mg2+等部分因素对DNA聚合酶的影响。 综上所述,借助DNA折纸程序化定位的优势以及AFM高分辨成像的特点,在单分子水平上达到了对DNA复制过程和结果的检测,此方法对探索DNA复制机制将起到一定借鉴作用,并对探索蛋白质与DNA相互作用提供了一种可行的方法。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/14805
Collection中科院上海应用物理研究所2011-2019年
Recommended Citation
GB/T 7714
王奇. 基于DNA折纸的DNA复制的原子力显微术研究[D]. 中国科学院研究生院(上海应用物理研究所),2014.
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