HRP催化的单颗粒检测探针的构建及单分子研究
徐艳
学位类型博士
导师胡钧 ; 樊春海
2016
学位授予单位中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)
关键词单颗粒 金纳米颗粒 局域表面等离子体共振 单分子 辣根过氧化物酶 葡萄糖氧化酶 级联反应
摘要传统的整体测定可以得到溶液中无数个颗粒或分子的平均统计结果,是一个共性的表达,而区别于平均结果,单颗粒及单分子的研究可以得到隐藏在整体结果下各个颗粒或分子的特性。本论文利用辣根过氧化物酶(HRP)催化的化学反应构建了单颗粒检测探针及进行单分子酶学研究。(1)单颗粒纳米检测探针的构建α-突触核蛋白(α-Syn)与前突触囊泡紧密相邻,被认为在一系列神经损伤和神经退行性疾病中起着介导神经毒性的作用。有研究通过电子自旋共振观测到α-Syn积聚过程中产生的羟基自由基,并认为由此造成的氧损伤致使黑质神经元细胞的死亡。然而,科研人员对于α-Syn在积聚过程中过氧化氢的作用机理仍然存在争议。针对这个问题,我们利用金纳米颗粒(Au NPs)设计了灵敏检测过氧化氢的探针。Au NPs具有局域表面等离子体共振的光学性质。这种光学性质促使Au NPs具有高亮度的散射光且光稳定性强,不易漂白;同时对所处的介电环境十分敏感。我们在Au NPs表面修饰了HRP,在存在过氧化氢的条件下,HRP催化苯胺在Au NPs的表面聚合成有序的聚苯胺(PANi)外壳,从而改变Au NPs的LSPR响应。我们结合暗场显微镜及光谱仪对反应的过程进行检测,发现该方法检测限可达8 nM。最后,我们检测了α-Syn聚集过程中过氧化氢的含量,体外实验结果表明外源性的过氧化氢在其积聚过程中可能起着更为重要的作用。(2)HRP单分子酶学的研究单分子酶学成为独立的研究领域起源于Xie课题组对胆固醇氧化酶的研究。并因其能够揭示隐藏在整体平均水平下的单分子酶与底物的动态相互作用而成为研究的热点。文献报道试卤灵-HRP的催化产物可非竞争性抑制HRP的活性。为了研究此反应中的酶催化的动力学信息,我们利用折纸易于修饰可寻址的特性,构建了研究单个HRP催化活性的单分子研究体系。我们将单个HRP固定在三角折纸上,并对折纸进行荧光修饰,从而将酶催化的产物位点与HRP位置共同定位。我们提取出单个HRP催化生成单个反应的荧光强度的变化轨迹并进行数学分析,构建了单个HRP催化的动力学模型。(3)单分子级联反应体系的构建生物体内中有序的级联反应使酶高速有效的行使自己的职能。然而许多科研工作者在体内或体外建立了各种精确调控级联酶间距的方法没有提纯纳米结构,只能得到不准确的级联反应的信息。为了得到级联酶催化的真实信息,我们构建了单分子条件下研究酶促级联反应的体系。我们利用折纸精确控制葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶级联反应对的间距,并用甘油区带超速离心的方法去除游离的酶分子,随后将纯化的结构固定在玻片表面,实时观测HRP催化GOx生成的过氧化氢氧化Amplex Red生成荧光产物。实验证明只有级联酶对完整时才能观测到荧光产物的生成,并且产物荧光变化的曲线实时反映了级联对催化的动态过程。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/26065
专题中科院上海应用物理研究所2011-2018年
作者单位中国科学院上海应用物理研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
徐艳. HRP催化的单颗粒检测探针的构建及单分子研究[D]. 中国科学院研究生院(上海应用物理研究所),2016.
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