电化学生物传感器在POCT中的应用研究
邓王平
学位类型博士
导师樊春海
2016
学位授予单位中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)
关键词Dna四面体结构探针 电化学生物传感器 间隙夹心法 细菌检测与鉴定 智能手机 性别鉴定
摘要本论文旨在利用电化学传感器优势结合DNA纳米结构及无机纳米材料对传感界面的调控及酶信号放大技术发展新型的高灵敏、高特异检测方法,并结合印刷电极的多元分析能力及传感器件的集成化发展快速,简单,便携及低成本的POCT检测器件用于生物分子的检测。针对医学诊断领域的细菌检测及鉴定需求及法医学现场性别鉴定需求,本论文构建了一系列电化学生物传感方法,具体开展了三方面的研究工作:首先,为了实现细菌的高灵敏检测及鉴定,我们根据细菌16S rRNA序列分别设计了特异和通用引物及探针,通过不对称RT-PCR获得了大量的ssDNA,并利用DNA四面体结构探针修饰界面,结合基于gap的夹心法和酶聚合体信号放大方法,对扩增的ssDNA产物进行检测,实现了快速、灵敏的细菌检测及特异鉴定。其中DNA四面体结构探针提供了刚性结构及类似溶液环境,从而提高了捕获探针与靶序列的杂交效率,而gap链探针不仅可有效打开较长靶序列自身二级结构,同时利用碱基堆积力提高了杂交效率及产物稳定性,进一步提高了DNA检测灵敏度。本方法对合成DNA的检测限可达到100aM,并通过高灵敏的不对称PCR产物检测实现9种细菌的单细胞水平检测,而且不受复杂样本的限制。同时,相对于实时定量PCR,我们的方法具有较好的细菌检测特异性。唯一美中不足的是,此方法需要PCR,不仅增加了操作步骤,而且难以达到优良的检测特异性。随后,为了实现快速、简单且更特异的细菌检测及鉴定,在前期基于PCR检测方法建立的基础上,我们以高丰度16srRNA序列为目标,通过保守区及可变区特异探针的设计及细菌高效裂解条件的筛选,同样利用DNA四面体结构探针修饰界面,并结合基于gap的夹心法策略和酶聚合体信号放大方法,实现了混合细菌直接裂解产物的高灵敏检测及特异鉴定,本设计中,gap链的引入使探针与16srRNA杂交形成完整的双链结构,从而有效避免了16srRNA的降解,提高了检测信号的稳定性,相对基于PCR的检测,该方法不仅能满足100?l全血样本中单细菌水平的检测,且具有良好的检测特异性。另外,我们结合纳米金修饰印刷电极界面,很好地将四面体探针的优势应用到印刷电极阵列上,即实现了低至1-100 CFU细菌的灵敏检测,又可以准确鉴定细菌种类,而且检测时间短(2h),操作简单,并可实现复杂混合样本中细菌的多元检测及鉴定。该方法不仅成本低廉,而且易于集成化和微型化,比如有望与微流控技术结合将样本处理及检测集成于一个器件中以满足临床及POCT检测所需。最后,鉴于现场法医分析缺乏用于生物样本分析的便携检测设备,我们开发了一种智能手机集成的电化学传感器件,并建立了一种基于酶级联检测的血清性别鉴定方法。芯片表面通过碳纳米管修饰及polyMB的功能化具备了高灵敏快速检测酶含量的优越性能,通过两种酶级联反应的结合,实现了不同性别的显著区分。相对于光学方法容易受到体液本身颜色的干扰,本方法在检测血清以及血清印迹中具有很好的稳定性。整个检测过程耗时短,可在20分钟内完成。鉴于智能手机的便携性很适合用于现场检测,此智能传感器件有望拓展应用到临床诊断,公共卫生,食品安全及环境监测领域的现场检测。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/26066
专题中科院上海应用物理研究所2011-2018年
作者单位中国科学院上海应用物理研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
邓王平. 电化学生物传感器在POCT中的应用研究[D]. 中国科学院研究生院(上海应用物理研究所),2016.
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