基于电化学传感器分析基因甲基化及羟甲基化修饰
陈世兴
学位类型博士
导师宋世平
2016
学位授予单位中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)
关键词Dna纳米结构 电化学 表观遗传学 基因甲基化 5甲基胞嘧啶 5羟甲基胞嘧啶 癌症 前列腺癌
摘要随着研究的深入,研究者对表观遗传的认识越来越清楚,表观修饰在基因表达、个体发育、癌症发生、发展等方面起到了重要作用。其中,研究的最清楚是甲基化胞嘧啶,尤其是在癌症的检测和治疗方面,甲基化胞嘧啶已经成为了肿瘤诊断的新标志物,同时其在药效评估、术后监控等方面的作用也越来越受到关注。而其去甲基化的中间产物羟甲基胞嘧啶,在去甲基化通路被解析之后,羟甲基胞嘧啶成为了表观遗传领域的一颗新星,是神经、记忆等领域新的研究热点。然而,利用传统的研究方法,并不能将甲基化胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶区分开,能将两者区分开的方法价格昂贵,例如色谱-质谱联用,需要大型的设备及专业技术人员。而纳米技术的发展,给该领域提供了一种全新的思路,纳米材料功能化的电化学技术因其简单、灵敏、高效、易微型化等特点,必将成为DNA甲基化和羟甲基化检测的主要方法。本文是利用实验室发展的纳米材料功能化的电化学平台,检测表观遗传修饰中的甲基化胞嘧啶及羟甲基胞嘧啶。我们使用了DNA纳米材料修饰的金电极平台和印刷电极相配的多通道电化学平台,分别分析了血清来源的DNA甲基化水平与前列腺癌的关系及小鼠的多种组织的整体水平上羟甲基胞嘧啶分布情况。具体来说如下:1基于DNA四面体电化学平台的基因甲基化检测DNA四面体结构,因其精确可控、提高类溶液环境、提高灵敏度等特性,已经被越来越多的应用到界面相关领域。本文依照实验室积累的方法,将四面体修饰到金电极表面,在其裸露的顶端修饰生物素,之后通过链霉亲合素的介导,将经过甲基化特异PCR(MSP)扩增产物偶联到电极表面,通过电学信号反应模拟基因特定部位甲基化情况。经过对比,该方法比同类型检测基因甲基化的方法检测限低了2-3个数量级,能检测到f M水平的甲基化DNA,同时在检测来自模拟血清中的DNA时,几乎不受影响。2基于E-MSP电化学方法的前列腺癌甲基化检测前列腺癌是男性中最普遍的疾病,且近些年其发病及死亡人数一直在增加。我们利用DNA四面体修饰的电化学平台偶联MSP(E-MSP)方法,在筛选的两种特异基因GSTP1和TNFRSF10D的基础上,分析了66例病人样本,并按照判别分析法将病人准确分类,将疾病患者与正常人,以及癌症患者与肿大患者区分,总的准确率分别为92.4%和82.6%,显著高于临床常用的前列腺癌诊断标志物PSA,极有可能成为替代PSA的新的诊断标志物。3基于多通道电化学传感器的全基因组水平羟甲基化检测羟甲基胞嘧啶在各种组织来源的基因组的整体水平差异很大,说明了羟甲基化修饰的组织特异性,并展示了基因差异表达之外的一种可能的调节方式。本文利用T4葡萄糖转移酶及化学修饰,将生物素标签修饰到基因组中所有羟甲基胞嘧啶上,利用DNA抗体将不同组织来源的基因组DNA吸附到印刷电极表面,并分别检测,并计算羟甲基胞嘧啶的总体含量。分析发现,羟甲基胞嘧啶在小鼠的脑组织中分布最高,而在癌细胞系中含量最低,这些结果与已发表的结果十分吻合。4基于多通道电化学传感器的基因特定位点羟甲基化检测羟甲基胞嘧啶在基因调节中的作用越来越清楚,其分布于基因的特定位点,因此研究基于特定位点的羟甲基变化是十分必要的。我们利用高钌酸钾能够氧化羟甲基胞嘧啶为醛甲基胞嘧啶的特性,同时结合硫化方法,在最后的产物中能在羟甲基胞嘧啶存在的位点产生错配,利用T7核酸内切酶I识别错配的能力,在该位点产生切割。同样利用多通道电化学结合印刷电极,分析特定基因的羟甲基化变化,以及这种变化和细胞分化的关系。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/26069
专题中科院上海应用物理研究所2011-2018年
作者单位中国科学院上海应用物理研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
陈世兴. 基于电化学传感器分析基因甲基化及羟甲基化修饰[D]. 中国科学院研究生院(上海应用物理研究所),2016.
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