免疫调控药物纳米金刚石-CpG寡脱氧核苷酸复合物的研究
张瑜
学位类型博士
导师李迪
2016
学位授予单位中国科学院研究生院(上海应用物理研究所)
关键词纳米金刚石 Cpg Odn 免疫刺激活性 抗肿瘤效应
摘要治疗型核酸,包括功能化修饰的寡脱氧核苷酸(ODNs),适配体(aptamers),小干扰RNA(siRNA),在一系列疾病(从遗传性到后天获得的疾病以及癌症)的治疗中显示出很强的应用前景。未甲基化的胞嘧啶-磷酸盐-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(CpG ODNs)就是其中一种具有免疫刺激活性的核酸,最初发现于病毒及细菌的DNA中。人工合成的CpG ODNs是一种很好的免疫佐剂,在抗感染、癌症以及过敏性疾病的中有广泛的应用。CpG ODNs的临床实验目前处于Ⅰ-Ⅲ期。然而,一些副作用的显现使其无法继续研究。这些副作用主要与高剂量的重复给药相关,因为单链CpG的细胞摄取率很低且很容易被代谢清除。因此,急需发展一种新的输运系统不但可以提高细胞的摄取率而且可以抵抗核酸酶的降解发挥长时间的免疫刺激效应。纳米材料作为控释的药物输运载体有广阔的应用前景。各种各样的纳米材料,从无机、有机到生物大分子都被用作CpG的载体刺激细胞产生相应的免疫反应。然而,高昂的费用及潜在的毒性效应限制了其在体内的应用。纳米材料的一系列载体中,纳米金刚石(NDs)拥有卓越的载运能力、灵活的表面可修饰性以及良好的生物相容性。特别是NDs在生理条件下可以自发形成多孔团簇结构,对于载运小分子化疗药物及生物大分子显示出“海绵”效应。这篇工作,我们采用多聚赖氨酸(PDL)修饰的功能化的纳米金刚石(fNDs)用于细胞内及体内CpG寡核苷酸的输运并且探讨其免疫刺激活性及潜在的抗肿瘤效应。主要研究内容和结果如下:(1)首先设计CpG ODN载体,用阳离子聚合物PDL修饰原始的NDs,形成fNDs复合物;随后通过静电相互作用吸附带负电的CpG,形成CpG-fNDs复合物。原始NDs的平均粒径为247nm,zeta电位为33.0eV;当包裹了带正电荷的PDL之后,fNDs的平均粒径增加到325nm,zeta电位增加到67.3eV;fNDs静电吸附了CpG之后,平均粒径进一步增大,达到338nm;然而Zeta电位则降低为40.6eV。(2)然后,我们使用激光共聚焦荧光显微镜评估cpg-fnds的细胞摄取。摄取时间为6h,细胞内平均荧光强度定量分析显示:与单链cpg相比,cpg-fnds组的细胞摄取率提高了将近3个数量级;之后研究摄取的cpg-fnds在细胞内的清除,结果显示在最初的6h摄取孵育结束后,24,48,72h细胞内的平均荧光强度分别是单链cpgodn组的900倍,830倍以及400倍。(3)接下来,我们研究了cpg-fnds的体外免疫刺激活性。结果发现cpg-fnds孵育raw264.7细胞6h,可以显著的促进肿瘤坏死因子(tnf-α)以及白介素-6(il-6)的释放。与单链cpg组相比,tnf-α和il-6的释放量分别提高到59倍及20倍。之后检测了长时间(24h,48h,72h)免疫刺激因子的释放,发现cpg-fnds组72h仍然可以检测到tnf-α和il-6的释放,释放量分别为单链cpg组的13倍及26倍。体外实验数据表明,cpg-fnds有长期的免疫刺激活性,在细胞水平可以持续3天。(4)为了进一步评估cpg-fnds潜在的治疗效应,我们又将免疫刺激研究进行到体内。icr小鼠尾静脉注射cpg-fnds之后测定小鼠血清中释放的免疫因子的表达量变化。结果发现在尾静脉注射3h后可以显著地诱发血清中il-12和il-6的释放。与单链cpg组相比,il-12和il-6的释放量分别提高了19倍以及61倍。接下来,我们研究了其长期的免疫刺激效果,发现48h的释放量仍有单链cpg组的4倍。体内实验同样证明,cpg-fnds有长期的免疫刺激活性,在动物水平可以持续2天。(5)既然免疫刺激效果如此好,那么在体内是否安全呢?我们使用近红外荧光染料xenolightcf750共价标记nds,监测其在体内生物分布和清除。结果发现,分布在各器官的nds在72小时会彻底清除。主要脏器病理切片及肝功能无明显变化,这些结果证实cpg-fnds在体内非常安全。(6)最后,我们评估了cpg-fnds的在tlr9阳性的肿瘤模型(b16-f0和4t1)的抗肿瘤效应。结果发现cpg-fnds可以显著的抑制肿瘤的生长,对于b16-f0和4t1肿瘤模型,抑瘤率分别为73.3%和28.4%。总之,我们开发了一种新颖的治疗型核酸输送系统,可以提高cpgodn的摄取,在体内外均有缓释效应,而且cpg-fnds复合物在小鼠肿瘤模型的成功应用,为癌症的免疫治疗提供了新的思路,更有可能将其设计并应用于纳米医药领域。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/26071
专题中科院上海应用物理研究所2011-2018年
作者单位中国科学院上海应用物理研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
张瑜. 免疫调控药物纳米金刚石-CpG寡脱氧核苷酸复合物的研究[D]. 中国科学院研究生院(上海应用物理研究所),2016.
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