基于功能DNA的单分子水平蛋白动态及活细胞蛋白递送研究
孙乐乐
学位类型博士
导师李宾
2018
学位授予单位中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)
关键词寡聚脱氧核糖核苷酸 Dna纳米结构 蛋白质动态相互作用 膜融合 蛋白质递送
摘要寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA)的功能主要是承载生物体的遗传信息。但是由于DNA的特殊性质,包括DNA杂交的特异性和可编辑性﹑长度和序列可调节性﹑导电性等,近年来被广泛应用于分析传感﹑纳米材料﹑逻辑计算及药物输运等交叉学科研究领域,成为一种闪耀的明星材料。种类丰富的功能化修饰是DNA得以广泛应用的另一方面重要原因。功能化修饰可以极大地丰富DNA的功能,使DNA与其它材料结合的可能性更高。同时得益于DNA本身的性质,整合了DNA的各种材料功能更加强大,应用也更加广泛。本论文所阐述工作的主要内容是利用功能化DNA及DNA纳米结构开发能够在单分子水平上观测蛋白质动态相互作用的方法以及特异性的不依赖于破坏内吞囊泡的活细胞蛋白质传递方法。主要内容如下:第一,将功能化DNA及DNA纳米结构与流动性磷脂双分子层结合起来,建立对酶促级联反应(葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶)动态过程进行单分子水平实时成像的方法。由于胆固醇可以自发嵌入磷脂双分子层,我们利用胆固醇功能化的DNA和不饱和磷脂构成的动态磷脂双层在玻璃表面构建流动性DNA单层,互补DNA和荧光分子双修饰的过氧化氢酶可通过杂交连接到流动性磷脂双层表面并进行自由运动。为能够利用普通全内反射荧光显微镜观测级联反应发生时葡萄糖氧化酶周围过氧化氢酶的运动行为和分布行为,我们构建了三角形DNA折纸筏将葡萄糖氧化酶锚定在流动性磷脂双层表面,并利用折纸筏上荧光标记的DNA指示酶的位置。通过单分子荧光追踪和成像,我们发现级联反应发生时葡萄糖氧化酶周围的过氧化氢酶扩散系数增加,但是其分布是随机的,原因可能是其自身快速的转动行为导致催化反应造成的推力不具有固定方向。第二,基于第一方面的工作,我们建立了在单分子水平观测细胞信号通路蛋白动态相互作用的方法。我们选取与细胞生命活动直接相关的PI3K/AKT通路中的两个激酶AKT2(上游)和GSK3β(下游)作为研究对象,并在哺乳动物细胞中表达了带生物素标签的AKT2和GSK3β。利用生物素-链霉亲和素特异性结合和生物素功能化的DNA对两种激酶进行DNA修饰,利用荧光标记的抗体对两种激酶进行标记。全内反射荧光显微镜成像证明了AKT2在磷脂双层上的动态连接以及GSK3β在DNA折纸筏上组装。利用该方法我们成功地实现了在单分子水平对AKT2和GSK3β的相互作用进行成像。该方法可以容易地应用到其它蛋白相互作用的研究。相比于传统定性研究蛋白相互作用的手段,该方法允许实时观测蛋白瞬态的相互作用过程,获取动力学信息。第三,我们将胆固醇功能化的DNA和脂质体结合,构建了模仿生物膜融合过程的特异性活细胞蛋白递送方法。我们将辣根过氧化物酶(HRP)作为外源蛋白质货物包裹在约100 nm的电中性脂质体中,然后用3’端胆固醇修饰的DNA对脂质体表面修饰。用5’端胆固醇修饰的互补DNA对靶细胞膜表面修饰。两种DNA以“拉链”式杂交将脂质体膜和细胞膜拉近,促进膜融合,进而释放蛋白质货物进入胞浆。HRP催化的荧光反应证明了方法的可行性。我们还利用链置换反应和杂交链反应探索了时空可控性膜融合。该方法不依赖破坏内吞囊泡,而且生物相容性很高。以上内容展示了功能化DNA及DNA纳米结构和其它材料碰撞所产生的新的研究思路。最后我们对上面的工作进行总结和展望。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/28503
专题中科院上海应用物理研究所2011-2018年
作者单位中国科学院上海应用物理研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
孙乐乐. 基于功能DNA的单分子水平蛋白动态及活细胞蛋白递送研究[D]. 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所),2018.
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