核酸纳米技术在活细胞成像和癌症免疫治疗中的应用
王则君
学位类型博士
导师王丽华
2018
学位授予单位中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)
关键词核酸纳米技术 Rna成像探针 活细胞成像 金属有机框架 免疫治疗
摘要DNA是编码,存储和传递遗传信息的核心载体,而RNA是具有重要生理意义的生物大分子,在基因表达和调控中起重要作用。DNA与RNA依靠着精确的互补配对原则共同创造了多元化的生命形式。除了作为遗传物质的载体,核酸还具备其他多种功能,例如核酸适配体依靠形成独特的二级或三级结构,可以特异性地识别和结合目标分子,而包含未甲基化的CpG序列的寡核苷酸链能够激活机体免疫功能等。然而,仅靠这些功能核酸还难以解决复杂的生物医学问题。随着纳米技术的发展,纳米材料优越的物理性质和化学性质也逐步受到了生物医学领域的关注。在本论文中,我们通过对这些生物相容性良好的功能核酸材料进行设计、改造并与丰富多样的纳米技术相结合,设计了可基因编码的普适RNA荧光探针并构建了有望应用于免疫治疗的智能核酸载体。主要研究内容和结果如下:(1)核酸适配体诱导的荧光互补探针(AiFC)的设计及其在活细胞mRNA成像中的应用。如何实现RNA生物学过程的可视化,发展活细胞内RNA分子的定位与追踪方法一直是生物成像研究的热点和难点。针对这一需求,本论文发展了一种适配体荧光互补(AiFC:aptamer-initiated fluorescence complementation)技术。通过对可特异性发出荧光的核酸适配体Broccoli进行碱基突变筛选,找到了最优的拆分位点;将拆分得到的两段序列分别与目标mRNA上的相邻序列融合,并将融合探针序列分别编码到质粒中进行表达。最终成功利用该技术实现了在多个细胞体系内对于多种高丰度,内源性mRNA的实时成像。只有当AiFC探针的两个片段同时结合到目标RNA上时才能发出荧光信号,因此大大降低了产生假阳性信号的可能。而AiFC探针的可编码性则为构建持续表达特异性探针的细胞体系提供了可能。随着RNA荧光适配体在亮度和光稳定性能上的不断优化,AiFC技术有望广泛应用于RNA与多种生物分子间相互作用的成像研究。(2)构建可基因编码的RNA荧光探针用于CDR1as环状RNA的成像环状RNA是最近备受关注的一类可调控多种基因表达的非编码RNA。目前,研究者尚无法对环状RNA进行有效的活细胞成像。针对这一技术难点,在实验中选取了功能研究较为成熟的CDR1as环状RNA,尝试应用AiFC探针对其进行活细胞成像。首先,我们确定了不同细胞系中CDR1as的表达量;随后延续使用了AiFC探针技术,将探针的识别区域选择在CDR1as环状RNA的接口位置。通过基因编码将对应的AiFC探针带入高表达CDR1as的U87细胞中实现了活细胞内环状RNA-CDR1as的定位和观察。此外,在后续实验中应用AiFC探针实现了对于HeLa细胞中过表达的CDR1as环状RNA的观察,验证了信号的特异性。该方法不仅实现了对活细胞内CDR1as进行荧光标记和观察,还确保了所观察到的CDR1as是成环后的结构,大大降低了背景。同时也进一步证明了AiFC探针的方法对内源RNA成像具有普适性。(3)基于纳米金属有机框架的智能核酸载药体系的制备及机制研究寡核苷酸药物在基因治疗,免疫疗法等方面具有广阔的应用前景。当前寡核苷酸药物应用的技术瓶颈主要在于实现药物的高效递送和可控释放。本论文将Zr-MOF骨架与具有p H响应性的磷酸钙外骨骼结合,成功构筑了一种可以高效负载非修饰核酸的通用智能载体isMOF,实现了CpG寡核苷酸的高效载运与释放功能。isMOF的“智能性”体现在:1)磷酸钙外骨骼不但可以保护所负载的核酸免受外界环境的破坏,还可以促进细胞摄取的效率;2)当isMOF被细胞摄取后,会迅速聚集于酸性小泡和溶酶体中。溶酶体内的酸性环境将破坏磷酸钙外骨骼进而触发大量磷酸根离子的原位释放。过量的磷酸根离子通过竞争有限的Zr结合位点,选择性的释放出吸附在MOF表面的核酸。该负载体系的CpG负载量优于纳米金颗粒,硅纳米材料等常用的无机纳米载体且具有优异的免疫刺激效果。该工作结合了固态核磁,理论模拟和细胞成像等一系列研究方法,阐明了Zr-MOF与核酸作用的机制及isMOF从内吞到在细胞内发挥作用的全过程。该智能核酸载药体系最大的亮点在于,嵌入了“保护-释放”的程序性设计,为今后开发出便于长期储存,运输和定点释放的核酸纳米药物提供了新思路。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/28515
专题中科院上海应用物理研究所2011-2018年
作者单位中国科学院上海应用物理研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
王则君. 核酸纳米技术在活细胞成像和癌症免疫治疗中的应用[D]. 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所),2018.
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